El primer paso para obtener un producto liofilizado es la solidificación del medio de la disolución. Se debe destacar que los agentes biológicos activos, células vivas con un equilibrio muy frágil, están sujetos a un fuerte estrés debido a la crio-concentración que ocurre durante este proceso y pueden provocar cambios de pH en el medio, a veces letales para ellos. En caso de utilizarse el disolvente más frecuente en la industria biofarmacéutica, agua para inyección, es por todos conocido que su punto de congelación es los 0ºC. Ahora bien, hay varios aspectos que provocan que la nucleación de la solución, el punto en que se inicia la formación de cristales de agua sólida, y por lo tanto empieza la congelación, sea en un rango de temperaturas inferior a ese punto. Existen varios elementos que pueden provocar la nucleación espontánea tales como la misma presencia de los excipientes y principios activos en la solución, así como las condiciones de proceso, las características del recipiente o la presencia de partículas, entre otros.

Estos provocan la aparición de heterogeneidad dentro de las muestras de un mismo lote, es por esta razón que caracterizar y controlar el momento en que empieza la nucleación es hoy y ha sido históricamente uno de los mayores retos en la estandarización del proceso de producción de un liofilizado. Para conseguir una congelación total del medio, se debe llevar la disolución a una temperatura en la cual se consiga minimizar al máximo la movilidad, fenómeno que ocurre por debajo de su temperatura de transición vítrea (denominada Tg’) característica de cada producto.

En la misma medida que la temperatura de nucleación, la velocidad de congelación es igual de importante. Ambos factores tienen influencia sobre la estructura final que tendrá el sólido y ésta determinará la velocidad de sublimación durante el secado primario. Una congelación lenta, con velocidades del orden de 0.1ºC-1.0ºC/minuto, promocionan el crecimiento de los cristales de agua, obteniendo cristales más grandes y una estructura con canales más amplios que favorecerán el paso del vapor. Los equipos de liofilización están diseñados de manera que se consigue una ratio de enfriamiento de las placas de entre 0.25ºC-2ºC/minuto. Velocidades de congelación superiores, pueden crear una matriz de cristales más pequeños en el seno de la estructura sólida que pueden dificultar la migración del vapor en el momento de la sublimación. De igual forma, hay tipos de excipientes comunes que se añaden a las formulaciones que requieren de tratamientos térmicos en este paso con el mismo objetivo, obtener una estructura sólida que propicie una liofilización segura. El tratamiento térmico, denominado annealing, debe llevarse a cabo por encima de la tempera de transición vítrea, ya que es el proceso mediante el cual se le aporta suficiente energía a la mezcla para facilitar la movilidad de la estructura, sin descongelarla, con el fin de reordenar y promocionar el crecimiento de todos esos cristales formados anteriormente.

Cuando la muestra se encuentra totalmente solidificada se procede a disminuir la presión del entorno en el cual se encuentra la muestra, extrayendo el aire del conjunto de la estancia para realizar el siguiente paso en condiciones favorables para la sublimación del disolvente.